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在PCR操作过程中应注意哪些??

优艾设计网 https://www.uibq.com 2023-02-03 18:54 出处:网络 作者:PS教程自学
张会峰 2021-08-09 18:06 1:避免交叉污染——勤换枪头和高压枪头和PCR管。2:引物设计要正确,选择可靠的生物公司合成引物,如果公司不好,给的引物会不出结果3:DNA提取要成功。4:引物和模板和体系所加的比例
张会峰 2021-08-09 18:06


1:避免交叉污染——勤换枪头和高压枪头和PCR管。
2:引物设计要正确,选择可靠的生物公司合成引物,如果公司不好,给的引物会不出结果
3:DNA提取要成功。
4:引物和模板和体系所加的比例要合适,模板过量会抑制体系的反应。
5:跑胶时注意区分开EB污染区和清洁区。
6:吸取试剂前不必每次都混匀,离心是为了把粘在壁上和盖上的试剂离下来。不离也优艾设计网_平面设计没关系,可以直接用枪头吸。但是配制的时候需要充分混匀,比如溶解引物,需要先混匀再分装。
7:DNA提取之后最好4度过夜之后再做PCR,这有利于DNA的充分溶解。
大家再来补充


ty世安 2021-08-09 18:09


1、PCR实验一定要保管好试剂,防止交叉污染,尤其是ddH2O2的交叉使用,极易引起污染。
2、NA处理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上,所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高压处理,常规消耗用品用后作一次性处理,避免反复使用造成污染。
3、PCR在超净台内进行,操作前后紫外灯消毒。
4、超净台内设内供PCR用微量离心机、一次性手套、整套移液器和其它必须品;移液品用一次性吸头和活塞的正向排液器,防止移液器基部污染。
5、PCR操作应戴手套并勤于更换。成套试剂,小量分装,专一保存,防止它用。配制试剂用新器具,用后作一次性处理。
6、试剂管用前先瞬时离心(10s),使液体沉于管底,减少污染手套与加样器机会。
7、最后加模板DNA(包括在石蜡油后),马上盖好,混匀,瞬时离心(10s),使水相与有机相分开。加入模板且忌喷雾污染,所有非即用管都应盖严。加模板DNA后应更换手套。
8、引物稀释时,要首先瞬时离心优艾设计网_平面设计,以避免粉末状引物在开盖时弹出管外。
9、实验设阳性、阴性对照。


anything 2021-08-09 18:15

优艾设计网_设计百科
要注意的问题太多了,
首先,在设计PCR引物时,结构要好,长度应在20bp左右,避免引物间形成引物二聚体。两条引物的退火温度尽量保持一致,最好是在55度左右。
其次,使用的DNA模板量是比较关键的,应使用纯度较高,基因组较完全,没有产生断链的基因组DNA。
然后是PCR体系中各个试剂的使用,比如说酶的纯度,活性,并且要注意酶量一定要适中,各DNTP的量要保持一致。
最后是PCR程序的设置。如果怕一开始就使用一个固定的退火温度扩增不出来,可以先小批量得试验温度梯度,或者用touchdown程序,即先设置一个较高的退火温度,这样引物的特异性结合会比较好,然后每个循环的退火温度都比上个循环低0.5度或1度,最终停留在某一个较合适的温度完成整个程序。


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