16SDNA空载如何解决？？

做16sDNA测序，但外包公司的结果空载很多。送样前用菌液做过PCR，而且条带很亮。我要的片段长度（1.5kb），我后来又用原先保留的菌液提取质粒做PCR结果显示有我要的条带，空白组也没污染，这是怎么回事呢？还有个问题：我的部分优艾设计网_设计百科测通序列拼接好后blast后结果发现不是要的序列，但是拼接好的序列有我的引物头，且片段长度符合。我用的是16s通用引物。哪位高手指点下这是为什么，如何解决这些问题。做了一个多月的测序了都还是没结果，我都快崩溃了！

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Amy王玲 优艾设计网_设计 2021-09-28 06:05

1）造成空载多的原因可能是连接做的不好，导致载体自连，转化之后大部分都是空载。
解决方法：控制好载体和PCR产物的比例，PCR产物要过量，这样能减少自连的情况。在转化过程中用蓝白斑显色，能直接看出克隆中是否带有插入片段，即使是阳性克隆，也最好做个PCR验证，确认插入片段符合目标长度。
2）测到的不是目标产物，那就是非特异性扩增的产物，可以尝试提高退火温度，增加引物和模板配对的特异性。16S扩增的片段中这种情况一般是比较少的。
3）建议用16S高通量测序替代克隆文库的做法，高效经济。

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瘦猴家的小胖妞 2021-09-28 06:05

空载，一个是没有片段插入。一个是培养过程中片段丢失。第二种不需特殊条件培养一般发生的可能性比较小。PCR鉴定易受外界环境条件影响，一般建议使用酶切鉴定。假如酶切鉴定没有问题那您可以使用扩增引物测序或者目的片段上引物进行测序，如若有插入片段可以得到测序结果，如若无片段结果为模优艾设计网_设计百科板与引物不结合.这样可以排除您实验问题.如您怀疑测序问题可以进行验证，验证方法一般为：取您的原始菌液重新接菌提取质粒进行测序反应，结果一致将收取两次费用，结果不一致将收取正确费用

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