目前，在研究一种原核菌优艾设计网_设计圈，已知它的酶cds序列和全基因组序列，想要做引物克隆出来，研究表达产物，该如何设计cds区克隆实验啊？
nanxinhui 2021-11-03 08:14
既然基因序列已知，就根据ATG。。。。TAG设计引物好了，这样克隆出来可以直接连到表达载体。可以用PRIMER5.0设计，也可以自己手动设计，要注意的就是两个引物退火温度不能相差太大，设计酶切位点的时候要注意优艾设计网_PS交流克隆出来的基因连到载体上不能移码突变。
检测cds序列可以用的酶切位点，上游引物：保护碱基+酶切位点+起始密码+引物，下游引物：保护碱基+酶切位点+终止密码+引物
_3310****026093 2021-11-03 08:20
既然已知其CDS序列的，就可以将该序列导入到引物设计软件中，设计好参数即可。
引物设计的软件，有在线的，也有需要下载安装的，例如DNA STA优艾设计网_设计百科R和primer premier等。然后根据设计原则在软件中选择合适的参数就可以了。
引物设计的原则有：
1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。
3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太 大。
5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。
6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。
若想了解更多信息，这里有个专栏。http://www.bbioo.com/experiment/12-810-1.html。
乌鸦高校 2021-11-03 08:29
原核的直接克隆。
真核的先提提RNA来做定量分析，cd优艾设计网_设计百科s区克隆先提rna逆转录，设计cds区引物来pcr然后粗略的测测序有个底，然后通过T载体连接到质粒上，最后导入目的菌里面表达，然后提出表达物来验证！大概思路是这样子的，仅供参考。
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